人工基因线路的研究进展和未来挑战
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人工基因线路设计的挑战
使用人工基因线路执行控制功能时，需要将该线路装载到不同的底盘生物中。不同领域的应用对底盘生物需求的多样性要求人工基因线路对底盘生物的适应性。为了达到此目标，需要对人工基因线路进行“模块化”设计。“模块化”是合成生物学元件的核心属性之一，设计目标是将生物系统拆解为功能上相互独立的模块，并保证模块间的拼装不会导致模块功能的改变。模块化设计能使构建的生物系统像电子系统一样进行规模扩展和尺度放大，因此合成生物学领域的大量工作都注重模块化元件的开发。然而，事实远比设想中复杂。基因回路并不能严格地和宿主细胞隔离，而是与细胞的生理状态耦合形成一个整体，人工基因线路会对细胞生理产生一些不可预知的干涉性影响，而这些干涉性影响也使理论上“模块化”的生物元件和基因线路失去了可预测性，不再“模块化”。这就导致在一种生物中精细刻画过的元件性质并不能在另一种生物中直接成立，因为元件一旦脱离了刻画时的细胞生理状态，其行为就有可能偏离预期。如果不能克服这个问题，合成生物元件就不能像电子元件一样使用简单元件逐步搭建复杂线路，而是需要耗费大量时间和精力对单个底盘生物中的元件进行点对点的优化。目前，人工基因线路的设计挑战主要表现在两个方面：①人工基因元件过表达引发细胞生长压力和细胞毒性；②细胞体内存在一些会影响人工基因线路功能的特殊生理机制。
人工基因线路过表达引发细胞生长压力和细胞毒性
细胞利用有限的资源完成营养物质摄取、能量代谢、DNA 复制、细胞分裂等诸多生理过程。为了优化自身的生长，细胞需要根据环境平衡分配这些资源。当人工基因线路的加入打破了这种平衡，就可能引发细胞生长压力（burden），影响细胞的正常生长。细胞的生长压力主要表现在两个方面：①人工基因线路在蛋白表达过程中占用了底盘细胞的 RNA 聚合酶和核糖体，以及相关的辅酶、能量等资源。②过量表达蛋白还可能引起细胞的应激反应，激活一些细胞应激途径如 ppGpp 等。除了生长压力，人工基因线路还可能带来细胞毒性（toxicity）。与生长压力不同，细胞毒性产生的原因是人工基因线路调控过程中的脱靶效应对底盘细胞的正常生理活动产生的干扰，而非由于对细胞内基础资源的占用。
当底盘细胞因为生长压力或细胞毒性而生长减缓时，会反过来对其内部人工基因线路的可预测性和遗传稳定性产生负面影响。例如，基于 TetR 家族阻遏蛋白设计的元件中，一些阻遏蛋白可能会与底盘细胞基因组上非特异靶位点的结合，从而影响底盘细胞的生长，同时也降低了这些元件的可预测性。此外，在细胞培养过程中，人工基因线路的序列可能产生各种随机突变。通常这些突变带来的影响非常小，但如果某种突变体为其所在的细胞带来了生长优势，就会很快占据群落的主体，使人工基因线路在群体层次上失效。例如，一种基于群体感应设计的、控制细胞群体大小的元件在传代培养 3—6 天后，就由于逃脱调控的突变体发生大量增殖而失效。
许多已经广泛使用的优质元件也因为自身的细胞毒性限制了其发挥和推广。例如，CRISPRi-dCas9（CRISPR interference-dCas9）调控系统被认为是优秀的可编程的调控元件，目前已被广泛用于基因线路的构建。然而，随着 dCas9 表达量升高，细胞生长会出现明显的迟滞。一些研究者认为该毒性来源于 CRISPR 的脱靶效应。因而在 CRISPRi-dCas9 的实际使用过程中，研究者需要耗费大量精力来平衡转录调控开关的正面影响与其对细胞生长的负面影响。合成生物学的元件设计最终要针对下游应用问题进行调整，而下游应用需要宿主细胞健康、快速生长，因此元件的细胞毒性将是合成生物学走向应用的瓶颈问题之一。