DNA的合成、组装及转移技术
|
|
基于同尾酶的BioBrick法和BglBrick法。同尾酶是识别不同的 DNA 序列但是能切出相同黏性末端的一类限制性内切酶，比如 XbaI 和 SpeI，但其切开的末端相互连接后不会再形成原酶切位点。利用这种“单向”的连接特性，可设计多轮连接以实现 DNA 片段组装。根据此原理设计的 BioBrick（生物积块）法（图 2b）可用于合成生物学中相关元件的标准化组装，但因其连接处会留下能编码终止密码子的痕迹序列，故不适用于融合蛋白的组装。为此 Anderson等采用 BglII 和 BamHI 替代 XbaI 和 SpeI，其切割末端连接后产生的痕迹序列可以编码对大多数融合蛋白无影响的“甘氨酸-丝氨酸”连接肽，此策略命名为 BglBrick 法。
基于 IIS型限制性内切酶的策略。BioBrick 和BglBrick 法虽然可以实现高效率的基因部件组装，但是其无法避免引入额外的痕迹序列。除了同尾酶，限制性内切酶中还存在一类 IIS 型限制性内切酶，其识别位点和切割位点不在同一个位置，因此可以根据需要放置内切酶的识别位点，以产生所需的黏性末端，用于多片段的无缝连接。2008 年，Engler 等根据此原理设计了 Golden Gate 拼接法，其可在一个反应体系里面实现多片段的高效无缝连接（图 2c）。笔者实验室在 Golden Gate 拼接法的基础上，设计了 YeastFab和 EcoExpress两个组装系统，用于工程细胞的代谢通路优化和蛋白表达，可达 90% 以上的 DNA 拼装效率。
基于多工具酶联合体系。无论是基于同尾酶还是 IIS 型限制性内切酶的连接法，由于其产生的黏性末端碱基数有限，难以支持更大片段的连接。实际上，体外的 DNA 片段连接，其核心都在于单链重叠区的产生和利用。为克服内切酶产生黏性末端长度不足的缺陷，Gibson 等直接放弃限制性内切酶，采用 5′ 核酸外切酶，联合 DNA 聚合酶以及 DNA 连接酶，开发了 Gibson 组装法（图 2d）。此方法一方面可以实现无缝连接，没有痕迹序列的残留；另一方面其能连接获得的片段大小可达几百 kb（千碱基对），大大提高 DNA 体外组装所能达到的量级。