人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)全文

2010年09月09日10:25 | 中国发展门户网 www.chinagate.cn | 给编辑写信 字号:T|T
关键词: 杀虫剂 蜱虫  综合征 中毒事件 疫情 血小板减少 疑似病例 发热 形体 重灾区 病原体

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(三)嗜粒细胞无形体核酸PCR检测。

目前,国际推荐使用16S rRNA基因检测方法,有条件的实验室,可进一步选用热休克蛋白基因groEL扩增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白细胞及蜱研磨液提取DNA。最后,以AE缓冲液50µl抽滤以提高回收的DNA浓度。如采用血液白细胞层提取DNA,可明显提高阳性检出率。实验时,应采集当地正常人血液同时提取DNA,作为PCR的阴性对照。

2. PCR扩增

(1)16S rRNA基因检测:16S rRNA 高度保守,是PCR检测最常用的扩增靶基因,巢式PCR检测可提高检测灵敏度和特异度,采用属特异及种特异引物同时进行检测。PCR检测应分区进行,避免污染。使用引物序列见表1。

1  巢式PCR检测无形体及埃立克体16S rRNA基因常用引物

引物名称

序 列

片段长度(bp)

Eh-out1(AF414399)

5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’

653

Eh-out2(AF414399)

5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’

Eh-gs1(AF414399)

5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’

282

Eh-gs2(AF414399)

5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’

HGA1

5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’

389

HGA2

5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’



PCR反应混合物的准备按常规进行。第一轮反应采用外引物对Eh-out1和Eh-out2,DNA模板10µl(白细胞提取的DNA可适当减少)。PCR反应体系总体积为25µl或50µl(需要进行PCR测序或克隆时,应适当扩大反应体系),其它成分的浓度按常规进行。反应程序如下:

94℃ 5min

40循环:94℃ 45sec

55℃ 50sec

72℃ 1min

72℃ 总延伸 5min

第二轮反应使用2对引物分别进行巢式PCR。2对引物分别是无形体属及埃立克体属通用内引物(Eh-gs1、Eh-gs2);以及HGA种特异性引物(HGA1及HGA2)。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板,阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。

(2)热休克蛋白基因groEL扩增

与groEL基因的应用相比,16S rRNA基因的应用更为广泛,但groEL基因在不同种属间具有较大的变异性。因此,对于诊断及菌株的鉴定,groEL基因均具有重要意义。该基因扩增使用巢式PCR,引物序列见表2。

2  groEL基因扩增常用引物   

引物名称

 

退火温度

片段长度bp)

HS1

5’-TGG GCT GGT  AA/CTGA AAT

52

1431

HS6

5’-CCI CCI GGI ACI  AC/TACC TTC

HS43

5’-ATA/TGCA/T AAG/AGAA GCA TAG TC

55

HGA480

HS45

5’-ACT TCA CGC/T)(C/TTCA TAG AC

HME528



DNA提取同上。PCR检测时,反应混合物的准备按常规进行。DNA模板量同16S rRNA基因检测。巢式PCR第一轮反应采用外引物对HS1及HS6。

反应程序如下:

3循环:94℃ 1min

48℃ 2min

70℃ 90sec

37循环:88℃ 1min

52℃ 2min

70℃ 90sec

68℃ 总延伸 5min

第二轮PCR引物采用HS43及HS45。检测样本取第一轮产物1-2µl为模板,阳性对照取0.5µl为模板。反应程序同第一轮反应。反应程序同第一轮反应,但退火温度由52℃改为55℃。

3.测序及分析

对扩增产物进行测序并进行同源比较,分析当地流行株与其它地区的变异性。

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