3 第一法高效液相色谱法（HPLC）

3.1 原理

试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

3.2 试剂与材料

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

3.2.1 甲醇：色谱纯。

3.2.2 乙腈：色谱纯。

3.2.3 氨水：含量为25％～28％。

3.2.4 三氯乙酸。

3.2.5 柠檬酸。

3.2.6 辛烷磺酸钠：色谱纯。

3.2.7 甲醇水溶液：准确量取50 mL 甲醇和50 mL 水，混匀后备用。

3.2.8 三氯乙酸溶液（1％）：准确称取10 g 三氯乙酸于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

3.2.9 氨化甲醇溶液（5％）：准确量取5 mL 氨水和95 mL 甲醇，混匀后备用。

3.2.10 离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH 至3.0 后，定容至1L 备用。

3.2.11 三聚氰胺标准品：CAS 108-78-01，纯度大于99.0%。

3.2.12 三聚氰胺标准储备液：准确称取100 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（3.2.7）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，于4℃避光保存。

3.2.13 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相当者。使用前依次用3 mL 甲醇、5 mL 水活化。

3.2.14 定性滤纸。

3.2.15 海砂：化学纯，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（SiO2）含量为99％。

3.2.16 微孔滤膜：0.2 μm，有机相。

3.2.17 氮气：纯度大于等于99.999％。

3.3 仪器和设备

3.3.1 高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

3.3.2 分析天平：感量为0.0001 g和0.01 g。

3.3.3 离心机：转速不低于4000 r/min。

3.3.4 超声波水浴。

3.3.5 固相萃取装置。

3.3.6 氮气吹干仪。

3.3.7 涡旋混合器。

3.3.8 具塞塑料离心管：50 mL。

3.3.9 研钵。

3.4 样品处理

3.4.1 提取

3.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等

称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和5 mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。

3.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等

称取2 g（精确至0.01 g）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4倍～6倍）研磨成干粉状，转移至50 mL具塞塑料离心管中，用15 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分数次清洗研钵，清洗液转入离心管中，再往离心管中加入5 mL乙腈，余下操作同3.4.1.1中“超声提取10 min，……加入5 mL水混匀后做待净化液”。

注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱净化。

3.4.2 净化

将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜（3.2.16）后，供HPLC测定。